GOLPH2表达及其干预预测并调节原发性肝癌术后IFNα治疗效果及其机制研究

【摘要】肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)(简称肝癌)是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第二位(全世界半数以上病例发生在我国)。在欧洲和美国,由于受丙型肝炎感染的影响,近年来发病率也呈上升趋势。近年来随着肝癌诊断和治疗技术的进步,部分患者通过早期诊断及早期根治切除获得了较好的疗效,根治切除术后的十年生存率已提高到30%左右。当前,手术切除仍是病人获得长期生存最有效的途径,但目前只有10%-20%肝癌病人在诊断时具有根治性治疗的机会；即使是根治性切除,其术后5年复发率仍高达60%-70%。其他治疗方式,诸如经动脉导管化疗栓塞(TACE)、索拉菲尼(Sorafenib)及干扰素(IFNa)治疗可使一部分患者获益,然而,由于无法区分哪些患者适合这类辅助性治疗及患者对此类药物副作用耐受不一,其治疗效果不尽人意。寻找能够区分和预测患者对此类治疗是否敏感的分子指标及提高药物疗效的分子干预对提高肝癌患者生存具有重要意义。IFNα是重要的肿瘤免疫治疗药物,已获美国FDA批准用于多种病毒性疾病和恶性肿瘤的治疗。包括我所在内的多家中心所开展的很多随机临床对照试验表明肝癌术后长疗程(>18个月)IFNα治疗是减少复发、提高生存的有效方法。然而国内肝癌患者绝大多数伴有乙肝肝硬化背景,肝脏代偿功能较差,血小板和白细胞处于一个较低的水平。术后大剂量长疗程IFNα治疗对患者肝功能和白细胞、血小板均构成了较为严重的影响,也增加了急性和慢性神经系统和血液系统损害等毒副作用,患者耐受性和依从性差。另外,患者对IFNα台疗反应不一,部分患者未能取得预期的治疗效果。如何筛选哪些患者适合IFNα治疗及在现有治疗方法基础上联合新的干预手段提高IFNα治疗敏感性是进一步提高IFNα防治效果的关键。课题组前期将激光捕获显微切割(LCM)和基因芯片技术相结合,研究伴和不伴肝外转移肝癌原发瘤之间基因表达谱的差异,发现了一组以高尔基体Ⅱ型膜蛋白GOLPH2(typeⅡGolgimembraneprotein)(又称GP73)为首、可能在肝癌转移进程中起重要作用并可能成为肝癌转移重要干预靶点的候选基因。已有报道GOLPH2在肝癌组织中表达显著上调,可作为肝癌潜在诊断指标。本研究中,肝癌患者术后应用IFNα治疗临床随机对照试验显示,GOLPH2低表达的患者,术后辅助应用IFNα治疗能显著延长其生存,而GOLPH2高表达患者术后辅助应用IFNα治疗,生存期未得到明显改善；体内外试验中我们发现,抑制GOLPH2表达后明显增强IFNα的抑肿瘤增殖作用,而高表达GOLPH2明显抑制IFNα的抑肿瘤增殖作用；进一步研究表明,作为高尔基体特异性跨膜蛋白,GOLPH2可能通过调节IFNα受体1(IFNαR1)的降解从而抑制干扰素作用的敏感性。当前,肝癌术后应用IFNα缺乏有效的预测指标,IFNα抗肿瘤作用有待提高,IFNα受体在IFNα抗肿瘤中的作用鲜有报道,这些都制约了IFNα在肝癌临床治疗中的广泛应用。因此,GOLPH2作为潜在的肝癌患者应用IFNα治疗预测指标及干预靶点在临床抗肿瘤研究中具有重要意义。第一部分GOLPH2在预测肝癌术后IFNα治疗效果中的价值目的：评估肝癌术后IFNα随机临床对照治疗试验肝癌标本组织中GOLPH2表达水平对肝癌术后IFNα治疗效果的临床预测价值。方法：通过组织芯片免疫组化染色检测142例肝癌术后应用IFNα治疗随机临床对照试验肝癌组织GOLPH2的表达,分析GOLPH2在肝癌术后IFNα(文中要统一用IFNα治疗组(测试组：n=69)和非治疗组(对照组；n=73)中的表达水平及其与肝癌术后IFNa治疗效果的相关性。结果：142例肝癌组织中,55例GOLPH2表达阳性,87例GOLPH2表达阴性。比较GOLPH2不同表达患者临床病理资料,发现GOLPH2阴性肝癌术后接受IFNα治疗(测试组)比不接受IFNα治疗(对照组)可获得更好的总体生存时间(OS,P=0.001)；但GOLPH2阳性肝癌接受IFNα治疗与否其OS没有明显差异。Cox比例风险回归单因素／多因素分析均表明IFNα治疗能显著延长GOLPH2阴性肝癌患者的生存。结论：GOLPH2可作为肝癌术后IFNα治疗效果的有效预测指标。第二部分肝癌细胞GOPH2表达水平及其干预在体内外实验中对IFNα治疗效果的影响目的：通过慢病毒载体介导的RNA干扰和过表达体系观察GOLPH2不同表达水平肝癌细胞系对IFNα治疗的敏感性及其在体内外不同环境中的抑肿瘤作用。方法：运用实时荧光定量PCR技术及Westernblot技术比较分析GOLPH2表达水平与IFNα治疗效果的关系。通过慢病毒介导的RNA干扰／过表达技术构建GOLPH2不同表达的肝癌细胞株,经体内外功能实验明确GOLPH2表达水平及其干预对IFNα治疗效果的影响。结果：qRT-PCR及Westernblot结果显示,对IFNα干预敏感肝癌细胞系(HepG2、PLC和BEL-7402)其GOLPH2mRNA和蛋白水平均显著低于对IFNα抵抗细胞系(HCC-97H和MHCC-LM3)。体外实验通过慢病毒载体介导的RNA干扰和过表达体系获得稳定的GOLPH2高、低表达肝癌细胞稳转株HCC-97H、HCC-97H-shGOPH2以及BEL-7402、BEL-7402-GOLPH2,发现对IFNα敏感细胞系BEL-7402过表达GOLPH2后对IFNα治疗抵抗,而IFNα抵抗肝癌细胞系HCC-97H抑制GOLPH2表达后对IFNα治疗敏感。体内实验发现皮下接种BEL-7402、7402-GOLPH2或HCC-97H、HCC-97H-shGOPH2细胞,并于第二周进行IFNα干预,过表达GOLPH2后IFNα抑制肝癌生长的作用明显减弱；而降低GOLPH2后小剂量IFNα就能抑制肝癌细胞的生长。在原位肝癌移植瘤模型中,对HCC-97H-shGOPH2进行回补并IFNα干预,发现回补GOLPH2能恢复对IFNα干预的抵抗,而回补GOLPH2的突变体不能恢复其对IFNα的抵抗。结论：GOLPH2的不同表达水平显著影响IFNα在体内外的抗肿瘤作用,下调GOLPH2明显促进IFNα的抗肿瘤作用,有望成为提高IFNα抗肝癌治疗效果的干预靶点。第三部分GOLPH2影响IFNα肝癌治疗效果的机制目的：探索GOLPH2不同表达影响IFNα肝癌治疗效果的可能机制,为潜在的分子干预提供理论基础。方法：通过慢病毒介导的RNA干扰/过表达技术构建GOLPH2不同表达肝癌细胞株,qRT-PCR和Western-blot等技术检测IFNα经典信号通路中多种分子转录和蛋白水平的变化。通过蛋白质谱分析GOLPH2可能调控的干扰素相关蛋白并进行功能分析。通过双荧光素酶报告基因测试系统分析GOLPH2的不同表达能否影响IFNα信号通路中PISRE启动子的结合及IFNα调控因子(IRFs)如P48的表达,探讨GOLPH2不同表达影响IFNα作用效果的分子机制。结果：不同肝癌细胞系IFNα干预12小时后,对IFNα敏感肝癌细胞BEL-7402、PLC、HepG2其IFNaR1高表达,刺激后STAT1、STAT2及IRF9(P48)显著上调；不敏感肝癌细胞系HCC-97H、MHCCLM3其IFNaR1低表达,干预后STAT1、STAT2及IRF9(P48)无明显变化。BEL-7402过表达GOLPH2后,IFNaR1转录水平没有差异,但蛋白水平有所降低；HCC-97H降低GOLPH2后,IFNαR1转录水平没变化,蛋白水平有所升高,说明GOLPH2参与了IFNαR1的降解。蛋白质谱分析显示GOLPH2有可能调控IFNαR1,进一步研究发现,GOLPH2通过AP2调控IFNαR1的泛素化降解从而抑制IFNα的相关功能。双荧光素酶报告基因测试显示GOLPH2的不同表达影响了IFNα信号通路中ISRE启动子的结合,荧光共聚焦及RT-PCR和Western-blot显示GOLPH2能影响IFNα调控因子IRF9(P48)的表达及分布。结论：GOLPH2通过影响IFNαR1降解及其下游信号通路影响干扰素抗肝癌作用。
【作者】郭磊；
【导师】叶青海；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肝细胞癌；高尔基体Ⅱ型膜蛋白；干扰素α；受体；蛋白降解；

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